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Sprouty1在人表皮角质形成细胞中的功能研究

发布时间:2019-05-07 14:01:40   编辑:化妆新闻网   阅读次数:

【摘要】:[研究背景] Ras蛋白是于1998年小号prouty Hacoh?n像果蝇基因表达谱/ MAPK信号传导途径特异性抑制蛋白,其类似物,然后也在哺乳动物中发现发现,命名Spry1-4。在果蝇中,蛋白家族是分子量63KD,在哺乳动物中,32-34KD的分子量。Sprouty1(SPRY1)蛋白质是富含半胱氨酸的蛋白质,所述第一对蛋白质的Spry,其是由RTK介导的FGF信号传导途径的拮抗剂的功能。一些调整SPRY1蛋白由生长因子,如成纤维细胞生长因子(FGF),表皮生长因子(EGF)等调整。同时,也SPRY1在一些细胞因子的负反馈调节中发挥作用。在果蝇和其他各种有机体,SPRY1蛋白在气管的形成,支气管肺形式,肾脏和血管生成发挥重要作用。 人蛋白的单个组分的SPRY表达在不同的人组织中的不同。SPRY1,2和4广泛表达于胚胎和成体组织时段,而SPRY3只在成人大脑和睾丸中表达。各组件之间的SPRY并不能起到相互补偿的作用。SPRY1人类基因位于4q28。如图1所示,包括一共有五个外显子,包括整个基因2626bp,编码包含319个氨基酸的蛋白。目前的研究发现,SPRY1基因拼接有在人体两具尸体,被命名为SPRY1a,SPRY1b。具有多个功能性结构域的蛋白质SPRY1结构,包括C-末端富含半胱氨酸的结构域,我。?。RAFL结合结构域,高度保守的N-末端结构域。蛋白家族的抑制,因为组分(SPRY1-4)之间SPRY结构相似性因此被认为该蛋白具有类似的一组通道的RTK。 SPRY1蛋白的信号转导途径几种生长因子的负调节在多种肿瘤中发现下调。SPRY1表达表型相似的细胞因子过度活化状态的下调。相关性间质转变 - 在各种细胞类型的肿瘤,包括乳腺癌,前列腺癌,肝癌和肺癌,特别是晚期肿瘤上皮细胞转移SPRY1的下调。SPRY1调节,以使表观失活或杂合性丢失被认为是在肿瘤细胞中减少的表达SPRY1或功能丧失的主要原因。由于拮抗RTK信号传导途径SPRY1发挥抗增殖,迁移,细胞分化和衰老重要作用的调制。因此,肿瘤SPRY1抑制被认为具有。 目前,影响表达SPRY1的调节的因素尚不清楚。多个生长因子,血清剥夺。一些研究表明,在不同的细胞环境,上述因素的调整并不完全一样SPRY1。SPRY1病目前尚未发现基因突变的一个直接结果。然而,研究表明,SPRY1基因也密切相关,肥胖,骨代谢异常等疾病状态的复杂性。 皮肤是人体的第一道防线,按结构可分为表皮,真皮和皮下组织。角质形成细胞作为表皮的主要结构单元的微调,是一个持续的增殖,分化和细胞更新,增殖和分化由许多因素。生发层是表皮的基底层。角质形成细胞增殖和分化状态被认为至少有三种状态,我。?。,表皮干细胞,瞬时细胞增殖和分化。最近的研究已经发现,多种细胞因子和生长因子的可影响角质形成细胞的动力学,如表皮生长因子,神经生长因子,成纤维细胞生长因子,血小板衍生的生长因子,IL-6,TNF-α维A酸,微RNA和其他角质化细胞的增殖和分化的影响。 SPRY1被认为具有RTK信号通路的重要分子负调控。在正常的人表皮,人角质形成细胞的形成SPRY1影响细胞的生物学行为和功能,如角质细胞分化,增殖和细胞周期的生物学功能,衰老,细胞凋亡是不明确的,因此,值得进一步研究和研究; 并提供了蛋白质分子和他们的增殖相关的皮肤疾病机制的进一步研究提供重要线索在一些表皮的。 [目的] 本研究中观察到的表达SPRY1在正常人表皮,以及角质形成细胞表达和定位的原代培养物; 通过形成细胞和HaCaT细胞表达SPRY1角质形成细胞,ERK的研究SPRY1,SMAD样细胞信号传导途径,细胞周期,增殖和调节蛋白的表达的分化,和组蛋白乙酰化和甲基化修饰等的效果构建慢病毒感染。中,为了理解的重要的下游靶蛋白SPRY1; 观察SPRY1对细胞功能的影响; K14的表皮表达观察SPRY1定位在银屑病小鼠模型中,皮肤接触过敏,伤口愈合,急性炎症反应等的刺激。 [方法] 首先,通过对正常人皮肤组织免疫荧光,在正常的人表皮原位定位和丰SPRY1观察到的表达。分离和原代角化细胞的培养,并且其中通过免疫荧光观察SPRY1和亚细胞定位表达的水平; 其次,为了进一步研究SPRY1形式的功能细胞在皮肤中,我们的过表达构建的质粒中,细菌DH五α由工具细胞-HEK293T包装细胞病毒放大,然后慢病毒感染原代角化细胞和HaCaT细胞,过表达细胞模型通过RT-PCR和慢病毒感染的免疫印迹效应建立SPRY1并确认。使用下游SPRY1蛋白分子如MAPK,PI3K-AKT,TGF-β过度表达之后的密切相关的蛋白质表达的Western印迹分析/ Smad信号传导途径和表皮屏障功能,细胞分化和细胞周期; 此外,我们还考察了其他表观遗传修饰的细胞SPRY1甲基化和组蛋白乙酰化水平的影响。此外,通过过表达SPRY1慢病毒稳定转染的细胞和筛选,建立进一步研究表达SPRY1 HaCaT细胞在细胞增殖,侵入和细胞凋亡的影响; 最后,为了进一步调查SPRY1的表皮中的作用,这项研究的表达靶向表皮建立K14-SPRY1-EGFP转基因小鼠,表达SPRY1咪喹莫特诱导银屑病体内(体内)模型,环锯伤口修复模型中,恶唑酮诱导的变应性接触性皮炎模型和PMA和斑蝥素对皮肤的刺激作用引起的急性炎症模型。 [结果] 在表皮细胞A,SPRY1表达形成和原代角质形成 1。通过免疫荧光组织在正常的人表皮SPRY1表达发现仅限于表皮的颗粒层,波浪线荧光分布,表皮的其它层的无显著表达。 2。形成细胞在体外培养的原代角质形成细胞,SPRY1表达水平较低,表明细胞质分布。 两个,SPRY1蛋白表达和影响细胞的功能角质形成细胞 1。在角质形成细胞,p53和p53水平的磷酸化SPRY1没有显著改变,但可以促进P21,P27表达,细胞周期蛋白向下B1,GOS2启动的表达,这可能与SPRY1细胞周期的抑制; 2。对细胞分化和已故的表皮屏障相关的组件SPRY1影响 角质细胞SPRY1,K1的表达的表达后,K10,丝聚蛋白和外皮没有显著变化。但表达AQP7,Iaminin5增加看出兜甲蛋白以上的结果提出表达表明过表达:SPRY1晚期分化并且可形成相关的角质细胞的皮肤屏障功能; 3。EMT相关蛋白影响细胞的角质形成细胞SPRY1 SPRY1角质波形。E-钙粘蛋白,β连环蛋白的N-钙粘蛋白的表达,并没有显著改变。PAI-1表达上调,整联α6,MMP3表达减少。PAI-1表达上调和下调MMP3限制细胞迁移的角质形成细胞的能力; 4。影响细胞的polycomb组蛋白(PCG)的蛋白质SPRY1角质形成细胞 细胞,Ring1B,EZH2和Bmil可见不同程度的减少在角质形成细胞中过表达SPRY1,以及上调SUZ12。生长反应蛋白-1(EGR-1)和轻微向下。Dickkopf1(DKK1)没有发现在表达显著的变化; 5。的SPRY1蛋白质修饰(甲基化和乙酰化)的细胞群体效应相关的蛋白质 形成在角质形成细胞,可以SPRY1 H3K4me2(lysine4,lysine27,lysine9)上调。然而,表达H3K79me2(lysine79,lysine36)和H3me3(H3tri甲基化)没有发现显著变化。H2A,H2B,H3和H4乙酰化H2A,H2B,H3和H4也没有发现显著变化。HDAC1,2,3,4和6没有显著变化,然而,磷酸化的HDAC4 / 5/7能见度显著下降; 6。对HMG表达SPRY1影响 SPRY1角质形成细胞中过表达模型,HMG蛋白质,包括HMGA1,HMGB1,HMGB2,HMGN1 HMGN2的家人并没有发现显著的变化; 7。效果SPRY1 SMAD的,ERK1 / 2,PTEN和AKT信号传导途径是 效果经典的细胞信号传导途径SPRY1角质形成细胞与其他肿瘤细胞系,如,形成在角质化细胞SMAD SPRY1,ERK1 / 2,磷酸化和影响PTEN的整体表达水平和AKT不明显; 8。SPRY1上的HaCaT细胞增殖,迁移,老化和细胞凋亡的影响 SPRY1过表达的HaCaT细胞增殖活性比对照组减少了约30%的。迁移和侵袭比对照组HaCaT细胞约降低29.9%。HaCaT细胞稳定转染的SPRY1,细胞凋亡(9比。03%)比对照组 - 空质粒慢病毒感染的细胞(3.8%)越高,并且差异有统计学显著(** P0.01)。形成在角质SPRY1表达比对照组HaCaT细胞低的细胞的衰老(8.2%/ 19.5%)。 S。作用在小鼠皮肤模型SPRY1外伤和炎症 1。SPRY1转基因小鼠,在咪喹莫特牛皮癣的模型中诱导药膏等。提出较轻的红斑鳞屑性皮肤反应银屑病。HE染色在组织病变,示出表皮增殖SPRY1转基因小鼠比野生型小鼠和较轻的程度; 2。在环伤口修复模型建立钻皮肤,伤口转小鼠SPRY1恢复时间比野生型小鼠的时间越长,我。e。,呈现更慢创伤修复过程; 3。在炎症的3%恶唑酮诱导的变应性接触性皮炎模型的转基因小鼠表现出SPRY1打火机耳肿胀和炎症可以通过比较HE和Masson三色染色的小鼠耳厚度的显著差异可以看出; 4。由PMA和斑蝥素刺激引起的急性炎症,转基因小鼠和野生型小鼠相似,可见肿胀和耳增厚,但并没有表现出两组间差异显著。 [结论] 首先,在正常的人表皮,在颗粒层中表达SPRY1限制; 第二,在正常的人原代角质形成细胞中的表达水平较低,作为胞质分布; 第三,角化细胞,促进SPRY1 P21,P27被上调,细胞周期蛋白B1和GOS2向下; 组蛋白的甲基化水平的变化,如H3K4me2(lysine4,lysine27,lysine9)HDAC4的表达上调,和磷酸化/显著减少的5/7等的细胞生存力。可以与增加细胞凋亡和降低相关的角质形成细胞的形成; 第四,在角质细胞,促进Iaminin5 SPRY1表达AQP7 ,,兜甲蛋白,所以SPRY1晚角质形成细胞的分化和保养皮肤的屏障功能有关; 五,SPRY1促进PAI-1的细胞的角质形成细胞中的表达,从而降低整α6,MMP3的表达,这可以EMT活力和细胞的迁移和角质形成细胞中的下降的形成; 第六,角质形成细胞,没有产生SPRY1 HMG蛋白家族显著的变化,对部分蛋白家族PCG(Ring1B,EZH2和Bmil下来,SUZ12上调),这需要进一步研究的具体机制和效果的表达不同的效果; 七,在角化细胞中,没有产生SPRY1 SMAD的显著变化,ERK,PTEN磷酸化和AKT以及播放整体水平形成,其可在细胞中形成,而不是SPRY1主要依赖于在角质形成细胞效应的信号通路; 八。SPRY1可以减少HaCaT细胞的增殖和侵袭,促进细胞凋亡; SPRY1发挥细胞生物学行为的负调控; 在转基因小鼠IX SPRY1表达,SPRY1减少咪喹莫特诱导银屑病样病变在表皮限制度位置,延迟的伤口愈合,减少恶唑酮诱导的变应性接触性皮炎的炎症的程度,但PMA和斑蝥素刺激引起的急性炎症反应没有显著改变。

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